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ger: Im Rahmen meiner Doktorarbeit befaßte ich mich mit dem Einfluß von RNA-Editing auf das Spleißen von ADAR Substraten. ADAR Proteine (Adenosin Deaminasen, die auf RNA wirken) wandeln Adenosine, die sich in doppelsträngigen RNA Strukturen befinden, in Inosine um. Eines der ADAR Substrate - die Glutamat-Rezeptor Untereinheit B (GluR-B) pre-mRNA - besitzt zwei zu editierende Adenosine, die im Bereich von Exons gelegen sind. Diese, Q/R und R/G genannten, Adenosine befinden sich jeweils in der Nähe eines 5` Spleißdonors. Die räumliche Nähe zwischen diesen beiden zu editierenden Nuuleotiden und den jeweils benachbarten 5` Spleißkonsensussequenzen wie auch die Basen-Paarung der Intron- und Exon-Sequenzen in der umgebenden RNA-Region weist auf eine Verbindung zwischen Editing und Spleißen hin.
Die Entwicklung einer neuartigen Zellkultur-gestützten Methode erlaubte mir die Analyse von Spleiß-Effizienzen. Mit diesem System konnte ich aufzeigen, dass Editing des R/G Adenosins zu einer signifikanten Reduktion der Spleiß-Effizienz des benachbarten Introns führt. Dieser Effekt ist allein auf das Vorhandensein von editiertem Adenosin, also Inosin, an der R/G Stelle zurückzuführen, und ist unabhängig von der Bindung von ADAR an diesen Bereich der RNA. Als mögliche Erklärung schlage ich vor, dass durch die Umwandlung von Adenosin zu Inosin eine Spleiß-Suppressor Konsensus-Sequenz entsteht. Nicht editierte GluR-B pre-mRNA zeigt häufig ein aberrantes Spleißverhalten, während editierte pre-mRNA korrekt gespleißt wird. In der Maus konnte kein Zusammenhang zwischen dem Editing des R/G Nukleotids und dem alternativen Spleißen der benachbarten Region festgestellt werden. In der Ratte dagegen gibt es eine Präferenz für das Verspleißen des editierten Exons mit dem Exon 15 der GluR-B RNA. Diese Ergebnisse lassen uns zu folgende Model vorschlagen: Das Editing an der R/G Region hemmt das Spleißen des benachbarten Introns und erlaubt dadurch den nachfolgenden Exons das geregelte alternative Spleißen. An der Q/R Region ist genau das Gegenteil der Fall. Hier kann das benachbarte Intron ohne Editing nicht gespleißt weren (Higuchi et al., 2000). Im Rahmen dieser Arbeit kann ich zeigen, dass nicht nur Editing des Q/R Nukleotids, sondern auch Editing in einer Region des Introns notwendig ist. Das Editieren dieser Adenosine zu Inosinen alleine reicht aus, um Spleißen zu ermöglichen. Dies geschieht möglicherweise durch das Auflösen der RNA-Sekundärstruktur im Q/R Bereich und durch die Inaktivierung einer Spleiß-Suppressor-Sequenz an der Editing Region im Intron.
Desweiteren habe ich potentielle Bindungspartner von Xlrbpa untersucht, um die zellulären Funktionen des Xenopus laevis RNA-bindenden Proteins zu charakterisieren. Zwei der möglichen Kandidaten, SUMO-1 und Lsm3, konnten als Bindungspartner bestätigt werden.
Da auch hnRNP Proteine sumoyliert werden, und da bereits bekannt ist, dass Xlrbpa mit hnRNAs assoziiert ist, ist es wahrscheinlich, dass Xlrbpa mit diesen RNA bindenden Proteinen über die SUMO-Modifikation interagiert. Es wurde vor Kurzem gezeigt, dass Homologe von Xlrbpa Teil des RNA Silencing Apparates sind. Eine Rolle in translationeller Suppression könnte auch für Xlrbpa in Frage kommen, da sein Bindungspartner Lsm3 Teil eines RNA Degradationskomplexes ist. eng: The first project of my thesis focuses on the influence of RNA-editing on the splicing efficiency of ADAR substrates. Adenosine deaminases that act on RNA (ADARs) convert adenosines to inosines in double-stranded RNA substrates. One of the substrates, the glutamate receptor subunit B (GluR-B) pre-mRNA, harbours two exonic editing sites, termed Q/R and R/G, which are located in the vicinity of a 5 splice site. The close proximity of splicing and editing sites and the base pairing of intronic and exonic sequences in this region suggest an interconnection of editing and splicing. Using a novel cell-based splice assay, we could show that editing at the R/G site leads to a reduction in splicing efficiency of its neighbouring intron. This effect is caused by the inosine at the R/G site; ADAR binding is not required. This suppression of splicing might be the result of an enhanced splicing silencer sequence created by editing.
Underedited GluR-B fragments tend to be incorrectly spliced, whereas proper splicing is enhanced by editing. There seems to be no correlation between R/G editing and downstream alternative splicing in the mouse brain, whereas in rat, indications exist for the preferential use of the flop module after editing of the R/G site. Here, I propose the following model for the influence of editing at the GluR-B R/G site on splicing of the downstream intron: Editing of the R/G site represses splicing at its neighbouring intron in order to allow proper alternative splicing.
This is in contrast to the GluR-B Q/R site, where the absence of editing inhibits splicing (Higuchi et al., 2000). In this study, I could show that editing of both the Q/R nucleotide and an intronic editing hotspot is required but also sufficient for efficient splicing of the intron neighbouring the Q/R site. This suggests that the resolution of the double stranded structure flanking the Q/R site and the neutralization of an intronic splicing repressor sequence is achieved by editing and is necessary for correct splicing. The second project of my thesis aims at the identification of binding partners of the Xenopus laevis dsRNA binding protein Xlrbpa in order to understand its cellular functions. The interaction of Xlrbpa with both the small ubiquitin like modifier (SUMO-1) and the Sm like protein 3 (Lsm3) are asserted in this study. HnRNPs are modified by sumoylation and can potentially interact with Xlrbpa via the covalently bound SUMO marker. This is indeed possible as Xlrbpa associates with hnRNAs. The interaction with Lsm3 which is part of an RNA degrading complex, and the fact that homologues of Xlrbpa are involved in RNA silencing suggests that Xlrbpa has a role in translational suppression.
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