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ger: Doppelstrang RNA-bindende Domänen (dsRBDs) sind häufige Motive in Proteinen die in RNA Prozessierung, Lokalisierung oder RNA Interferenz involviert sind. Für RNA Bindung spielt dabei die Sekundärstruktur der RNA und nicht ihre Sequenz die entscheidende Rolle.
Adenosine deaminases that act on RNA (ADARs) sind dsRBD-beinhaltende Proteine, deren Aufgabe die Deaminierung von Adenosin zu Inosin in spezifischen doppelsträngigen RNA Substraten ist. Die modifizierten Basen befinden sich häufig nahe an 5´ Spleißstellen und haben infolgedessen einen breiten Einfluß auf RNA Spleißen und Stabilität.
Korrektes Spleißen der mRNA der Untereinheit B des Glutamatrezeptors benötigt zum Beispiel RNA Editierung durch ADAR an mehreren Stellen, unter anderem auch an der R/G Position in Exon 13, die nur 2 Nukleotide von der 5´ Spleißstelle liegt. Der genaue Mechanismus, wie Deaminierung an der R/G Position Spleißen beeinflußt, ist jedoch unklar. Wir vermuteten, dass Inosine an dieser kritischen Position die Interaktion der 5´ Spleißstelle mit U1 snRNA ändert. Diese Hypothese wurde experimentell durch eine kompensierende U1 snRNA Mutante getestet.
Weiters weist die Umgebung der R/G Stelle Ähnlichkeiten mit spleißhemmenden Sequenzen auf, an denen reprimierende Proteine wie hnRNP A1 und hnRNP H binden. Deswegen wurde auch die Interaktion dieser Faktoren mit der R/G Stelle untersucht.
Die Vorläufer der microRNAs (microRNA precursors) stellen eine weitere bedeutende Klasse von ADAR Substraten dar. Die Prozessierung dieser Vorläufer ist ebenfalls stark durch RNA Editierung geändert. Sie werden, zum Beispiel, suszeptibel für den Abbau durch die cytoplasmatische Ribonuklease Tudor-SN. Da ADAR1 ein dsRNA-bindendes Protein ist, das zwischen Nukleus und Cytoplasma wandert und mit Exportin5, dem Hauptexportrezeptor der microRNA Vorläufer interagiert, wurden co-immunpräzipitierende Methoden angewandt, um die Interaktion von ADAR1 und editierten microRNA Vorläufer sowohl im Nukleus als auch im Cytoplasma zu untersuchen.
In eukaryotischen Genomen findet man Short Interspersed Elements (SINEs) als transposable Elemente, die durch ein RNA Intermediat mobilisiert werden. Dieses RNA Intermediat interagiert mit dsRBD-beinhaltenden Proteinen, die wichtig für Transkription und Translation sind. Diesbezüglich wurde gezeigt, dass pflanzliches SB1 SINE RNA mit dem an partielle doppelsträngige RNA bindenden Protein HYL1, jedoch nicht mit DRB4, das für die perfekt doppelsträngige RNA Struktur spezifisch ist, in vitro interagiert. HYL1 ist ein wichtiger Faktor der microRNA und tasiRNA Produktion in Pflanzen. Die Bindestelle für HYL1 an SINE RNA befindet sich an einer stem-loop Struktur, die stark an microRNA Vorläufer erinnert. Dies lässt Schlüsse zu, wie SINE RNAs RNAi Wege bestimmen könnten.
eng: The double-stranded RNA binding domain (dsRBD) is a common motif found in proteins involved in RNA processing, localisation or interference. RNA recognition by these proteins depends on the secondary structure and not on the sequence.
Adenosine deaminases that act on RNA (ADARs) are dsRBD-containing proteins which modify target adenosines into inosines in double-stranded RNA substrates, frequently in vicinity of 5´ splice sites, having a profound impact on the subsequent RNA processing events, including RNA splicing and stability. Accurate splicing of messenger RNAs coding for the subunit B of the glutamate receptor, for example, relies upon ADAR-mediated RNA editing at several positions, including the R/G site located in exon 13, just two nucleotides upstream of the exon-intron border. The exact macromolecular interaction affected by deamination at this site, however, has not been identified. We postulated that inosine in this critical position influences U1 snRNA base-pairing to this imperfect 5´ splice site. This hypothesis was tested by employing compensatory U1 snRNA mutants. Furthermore, the sequence surrounding the edited R/G site strongly resembles a splicing silencer consensus bound by splicing repressor proteins, like hnRNP A1 or hnRNP H. Therefore, the interaction between R/G site and these proteins was also investigated.
MicroRNA precursors represent another prominent class of ADAR substrates whose processing is substantially altered upon RNA editing, as they become sensitive to cleavage by Tudor-SN, a cytoplasmic ribonuclease.
Since ADAR1 is a dsRNA-binding shuttling protein that interacts with Exportin5, a main export receptor for miRNA precursors, a co-immunoprecipitation method was exerted to detect the interaction of ADAR1 and edited miRNA precursors in both nucleus and cytoplasm.
In eukaryotic genomes, short interspersed elements (SINEs) are transposable regions mobilised through an RNA intermediate that interacts with dsRBD-containing proteins crucial for transcription and translation control. In this part of the study, it is being shown that plant SB1 SINE RNA interacts strongly with imperfect dsRNA-binding protein HYL1, a key factor in the microRNA and trans-acting small interfering RNA (tasiRNA) production in plants, but not with perfect dsRNA-specific protein DRB4 in vitro. The binding site maps to stem-loop structure highly reminiscent of miRNA precursors, suggesting how SINE RNAs could regulate different RNAi pathways.
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